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May 16, 2023

Un método de alto rendimiento para medir el tamaño de los huevos en Drosophila

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3791 (2023) Cite este artículo 689 Accesos 2 Citas 4 Detalles de métricas altmétricas Los rasgos de la historia de vida se utilizan como indicadores de aptitud en insectos, incluidos

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 3791 (2023) Citar este artículo

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2 citas

4 altmétrico

Detalles de métricas

Los rasgos de la historia de vida se utilizan como indicadores de aptitud en insectos, incluida Drosophila. El tamaño del huevo es un rasgo adaptativo y ecológicamente importante, potencialmente con variación genética entre diferentes poblaciones. Sin embargo, el bajo rendimiento de la medición manual del tamaño de los huevos ha obstaculizado el uso generalizado de este rasgo en biología evolutiva y genética de poblaciones. Establecimos un método para la medición precisa y de alto rendimiento del tamaño de los huevos de Drosophila utilizando citometría de flujo de partículas grandes (LPFC). Las estimaciones de tamaño utilizando LPFC son precisas y altamente correlacionadas con las mediciones manuales. La medición del tamaño de los huevos es de alto rendimiento (un promedio de 214 huevos medidos por minuto) y los huevos viables de un tamaño específico se pueden clasificar rápidamente (un promedio de 70 huevos por minuto). La clasificación por LPFC no reduce la supervivencia de los huevos, lo que la convierte en un método adecuado para clasificar huevos para análisis posteriores. Este protocolo se puede aplicar a cualquier organismo dentro del rango de tamaño detectable (10 a 1500 m) de los citómetros de flujo de partículas grandes. Discutimos las posibles aplicaciones de este método y brindamos recomendaciones para optimizar el protocolo para otros organismos.

El tamaño de los huevos es un rasgo importante en los insectos que han evolucionado en respuesta a presiones ecológicas y de desarrollo1. El tamaño de los huevos y otros rasgos de la historia de vida (por ejemplo, supervivencia, longevidad y fecundidad femenina) son indicadores de la aptitud de los insectos. En Drosophila melanogaster, el tamaño del huevo afecta otros rasgos de la historia de vida, por ejemplo, la viabilidad embrionaria, la tasa de eclosión y el desarrollo embrionario2, y características morfológicas como el patrón embrionario anteroposterior3,4. El hacinamiento de larvas5 y factores ambientales como la temperatura influyen en el tamaño del huevo de D. melanogaster6,7,8. El tamaño del huevo de D. melanogaster aumenta con la latitud en Australia y América del Sur7, lo que sugiere que es un rasgo adaptativo bajo selección estabilizadora2. Drosophila es uno de los organismos multicelulares sexuales más utilizados en biología evolutiva. Esta popularidad se debe en parte al corto tiempo de generación de Drosophila y a su facilidad de mantenimiento en condiciones de laboratorio. A pesar del uso generalizado de Drosophila, el tamaño del huevo rara vez se estudia en estudios de biología evolutiva y de poblaciones, en parte debido al bajo rendimiento de la medición manual del tamaño del huevo.

Tradicionalmente, el tamaño de los huevos se medía al observarlos con un microscopio o estereoscopio2,7,8,9,10. Alternativamente, los huevos se fotografían bajo un microscopio y sus tamaños se miden manualmente a partir de las imágenes3,4,11,12. Recientemente, se desarrollaron algunas herramientas de análisis de imágenes para calcular automáticamente el tamaño de los objetos13,14. Los métodos que se basan en mediciones manuales consumen mucho tiempo y son tediosos porque los huevos deben transferirse manualmente y colocarse en la orientación adecuada antes de tomar las imágenes. La medición manual del tamaño del huevo también es propensa a errores debido al sesgo del experimentador. Los procesos de análisis de imágenes también requieren que las muestras se fotografíen sobre un fondo con un color y brillo específicos13. Además, las mediciones manuales o las herramientas de análisis de imágenes generalmente no pueden garantizar la recuperación de óvulos viables que puedan usarse para análisis posteriores.

La citometría de flujo permite clasificar y medir el tamaño de forma rápida y precisa de objetos pequeños de hasta 200 µm. Pero el tamaño medio de los huevos en el subgrupo de especies de D. melanogaster oscila entre 400 y 600 µm4,5,8,9,10, lo que es demasiado grande para procesarlos con los citómetros de flujo tradicionales. La llegada de la citometría de flujo de partículas grandes (LPFC) ha hecho posible la medición de objetos vivos de hasta 1500 µm. Los sistemas LPFC funcionan con un caudal más lento y presiones más bajas en comparación con los citómetros de flujo tradicionales para evitar fuerzas de corte disruptivas. LPFC se ha utilizado para el análisis de organismos transgénicos o marcados con fluorescencia, por ejemplo, huevos de nematodos15, D. melanogaster16 y Anopheles gambiae17, y larvas de coral18. Los objetos etiquetados no fluorescentes también se pueden analizar y clasificar en LPFC únicamente según su tamaño. Sin embargo, en ausencia de etiquetado fluorescente, la forma de los objetos afecta la precisión de la estimación del tamaño. Por ejemplo, la forma de las semillas de Arabidopsis es esferoide alargada o cardioide19, por lo que la medida del tamaño de las semillas de Arabidopsis es casi independiente de la orientación de las semillas20. Sin embargo, para objetos con formas elipsoides achatadas o alargadas, como los huevos de Drosophila, el tamaño estimado puede variar dependiendo de la orientación de los objetos en el citómetro de flujo. El tamaño del objeto se mide correctamente sólo cuando los objetos están orientados a lo largo de su eje, pero puede subestimarse si los objetos no pasan a lo largo de su eje (Fig. 1A, B).

Filtrado in silico de desechos y objetos desalineados utilizando perfiles de densidad óptica. (A) Los huevos de Drosophila son elípticos y se obtiene una medición precisa del tamaño basada en el tiempo de vuelo (TOF) cuando un huevo se alinea en su eje longitudinal. (B) Se subestima el tamaño de un huevo desalineado, es decir, alineado sobre su eje corto. Los huevos desalineados se pueden identificar basándose en el índice de elipticidad (EI) y la relación W/L, donde W es la densidad óptica máxima de un objeto y L es el número de mediciones de extinción a lo largo del tiempo de vuelo de un objeto. (C) La distribución de tamaño inicial es bimodal (sin filtrado). El primer modo corresponde a los desechos y partículas de levadura, y el 'Filtrado de desechos' elimina estos pequeños objetos. Otros pasos de filtrado basados ​​en los parámetros EI y W/L (filtrado desalineado) eliminan los huevos desalineados. El tamaño está en unidades de µm. La distribución de la longitud del huevo de la muestra Dsim196 se muestra en C: las estadísticas de la distribución de la longitud del huevo se presentan en las Tablas S1 y S2, y el histograma de la distribución de la longitud del huevo se muestra en la Fig. S3.

En este estudio, desarrollamos un método para medir la longitud de los huevos de Drosophila utilizando LPFC. En este método, filtramos los huevos que no están orientados correctamente a lo largo de su eje largo in-silico y medimos con precisión la distribución de longitud de los huevos de Drosophila. La medición de la longitud del óvulo es precisa, rápida y tiene un alto rendimiento. Los huevos de un rango de tamaño específico se pueden clasificar con precisión y convertirlos en adultos sin reducir su viabilidad. Discutimos el potencial de utilizar este enfoque para investigar la variación natural y la base genética del tamaño del huevo en Drosophila. LPFC se puede utilizar para medir el tamaño de cualquier organismo dentro del rango detectable (10–1500 µm) de este instrumento. Proporcionamos recomendaciones para optimizar el uso de LPFC para otros organismos, en particular cuando su forma se desvía del esferoide.

Los estudios sobre D. melanogaster han utilizado la longitud del huevo3,4,8,10, el volumen del huevo2,6,7,11,12,21 o tanto la longitud como el ancho del huevo9 como sustitutos del tamaño. El volumen del huevo es una medida compuesta que generalmente se calcula usando la fórmula \(\frac{1}{6}\pi L{W}^{2}\) donde L, longitud, corresponde al eje de simetría rotacional y W, ancho, es el eje perpendicular a la longitud1. El volumen de huevos, junto con el número total de huevos, puede utilizarse como medida de la inversión reproductiva6. Sin embargo, cuando el volumen del huevo se utiliza como indicador del tamaño, las diferencias inter o intraespecíficas no pueden atribuirse directamente a la variación en sus componentes, es decir, longitud y ancho.

Una ventaja de medir el largo o el ancho de los huevos como sustitutos del tamaño es que pueden evaluarse como rasgos distintos. Estos atributos del tamaño del huevo pueden contribuir de manera diferente a la variación del tamaño del huevo entre diferentes especies y poblaciones. Por ejemplo, en poblaciones seleccionadas artificialmente para un mayor volumen de huevos, se ha demostrado que los huevos son más largos12. La validación funcional de algunos genes candidatos identificados en estas poblaciones también ha demostrado que estos genes afectaron la longitud del óvulo11. Esto sugiere que un aumento en la longitud del huevo (probablemente además del aumento en el ancho del huevo) ha contribuido al mayor volumen de huevos. En este estudio, utilizamos la longitud del huevo como indicador del tamaño del huevo porque podemos medir la longitud con precisión con el método de alto rendimiento que hemos desarrollado.

Los ensayos para la distribución de la longitud de los huevos se realizaron utilizando 12 líneas endogámicas de D. simulans22, Lausanne5 (D. melanogaster), Dere01 (D. erecta), Dsan01 (D. santomea) y Dmau151 (D. mauritiana). Excepto D. simulans, todas las líneas endogámicas se obtuvieron del centro de stock de Bloomington. El resto de los ensayos se realizaron utilizando una población exógama que se estableció a partir de 97 líneas endogámicas de D. simulans22 mediante un esquema de cruce por turnos. Mantuvimos los cruces durante 15 generaciones a 25 °C y mezclamos un número igual de cruces para establecer la población exógena. La población exógena y las cepas de Drosophila se mantuvieron en medio estándar de Drosophila a 25 ° C con 12 h de luz y 12 h de oscuridad al día y entre 50 y 60% de humedad. El hacinamiento de larvas5 y la temperatura6,7,8 afectan el tamaño de los huevos de D. melanogaster. Para reducir los efectos ambientales, mantuvimos los cultivos de moscas a baja densidad (400 huevos/botella) utilizando un método de pipeteo23 durante al menos dos generaciones antes de medir el tamaño de los huevos. En resumen, el volumen de huevos lavados se comparó con una serie de tubos que contenían un volumen conocido de 1 × PBS que oscilaba entre 50 y 70 µl. El volumen de huevos se ajustó a 60 µl, luego se añadieron 1200 µm de 1 × PBS, es decir, 20 veces el volumen de huevos. 200 µl de esta suspensión contenían una media de 400 huevos que se transfirieron a una botella. El protocolo se puede ajustar para tener en cuenta la diferencia en el volumen de huevos entre diferentes especies y poblaciones.

Se transfirieron alrededor de 500 individuos de 4 a 6 días de edad (proporción de sexos de ~ 50:50) a una jaula de recolección de embriones (Cat. #59–101, Genesee Scientific) con una placa de agar de 10 mm (4 % de agar y 4 % de sacarosa) cubierta. con pasta de levadura para facilitar la oviposición24. Aunque la edad de las hembras no afecta la longitud del huevo4,8,10, restringimos las mediciones a los huevos puestos por hembras de 4 a 6 días de edad. Limitamos el período de oviposición a 17-19 h para evitar la eclosión de los huevos. Se agregaron unas gotas de agua tibia a la placa de agar para disolver la pasta de levadura y la solución de levadura y agua junto con los huevos se transfirió a una red fina usando un cepillo. Los huevos se lavaron con agua hasta que se disolvieron todos los granos de levadura y luego se transfirieron a un tubo de 1,5 ml que contenía 600 µl de 1x PBS.

Ejecutamos todas nuestras muestras en una máquina Biosorter® (Union Biometrica) con unidades de ensamblaje de núcleo óptico y de fluidos (FOCA) de 1000 µm utilizando 1 × PBS como solución de funda. Para evitar la obstrucción de la celda de flujo, resuspendimos los huevos en 1 × PBS de modo que se alcanzó la densidad final de ~ 400 huevos/ml. Utilizamos el método de pipeteo23 descrito anteriormente para ajustar la densidad de los huevos. Las muestras se agitaron continuamente usando un agitador mecánico en un vaso de muestra de 50 ml y se trasladaron a la celda de flujo rodeada por la solución envolvente (1 x PBS) que las enfocó en el centro de la corriente donde fueron interrogadas por múltiples láseres. Ejecutamos Biosorter® usando el software FlowPilot ™ usando un vaso de muestra de presión 0.60–0.65 y un desviador de presión 1.2. Si se debían clasificar las muestras, se generaba una gota que contenía líquido y el objeto clasificado, que caía en el recipiente colector. Clasificamos las muestras utilizando los siguientes parámetros: ancho de caída de 22 ms (ms) y retraso de clasificación de 28 ms. Limpiamos el agitador mecánico con agua destilada y el sistema con 1 × PBS después de procesar cada muestra para evitar la contaminación cruzada.

El citómetro de flujo de partículas grandes mide dos características ópticas de los objetos: el tiempo de vuelo (TOF), que es el tiempo que cada objeto bloquea la luz, y la extinción (EXT), que está determinada por la señal integrada total de la luz bloqueada (Fig. S1). . Medimos el TOF de perlas de referencia de poliestireno (200 y 430 µm) y ajustamos un modelo de regresión lineal utilizando TOF como variable de respuesta y tamaño como variable explicativa. Utilizando la intercepción y la pendiente estimadas, las mediciones de TOF de todas las muestras se convirtieron al tamaño (tamaño = 5,94 TOF—491,78). El software FlowPilot™ permite la visualización en tiempo real de EXT y TOF de objetos como diagramas de dispersión y se pueden elegir regiones de interés, es decir, puertas, en este diagrama para clasificar objetos (Fig. S1). Según el tamaño estimado utilizando mediciones TOF, se configuraron múltiples puertas que correspondían a diferentes rangos de tamaño (Fig. S1). Estas puertas se utilizaron para clasificar los huevos que se dispensaron en 1 x PBS.

La distribución de tamaño de los huevos en todas las muestras analizadas fue bimodal (curva 'Sin filtrado' en la Fig. 1C). La inspección manual de los objetos en el primer modo reveló que los objetos son en su mayoría desechos y partículas de levadura, mientras que las partículas en el segundo modo eran todos huevos de Drosophila. Por lo tanto, filtramos los objetos que correspondían al primer modo ajustando primero una distribución de densidad del núcleo a la distribución de tamaño y luego identificando el límite entre los dos modos. En resumen, ajustamos la estimación de la densidad del núcleo que está controlada por un parámetro de suavizado, es decir, el ancho de banda, a la distribución de tamaño. Para identificar un ancho de banda adecuado para suavizar la distribución de densidad, realizamos una búsqueda exhaustiva en un rango de anchos de banda ajustando la función de densidad del núcleo con una forma gaussiana. Realizamos una validación cruzada de K-Folds dividiendo el conjunto de datos en conjuntos de tren y de prueba. Dividimos los datos en cinco pliegues; cuatro pliegues formaron el conjunto de entrenamiento y un pliegue se utilizó como conjunto de validación. Se eligió el mejor ancho de banda que otorgaba la puntuación más alta como ancho de banda para suavizar la distribución de densidad del kernel. Luego calculamos la probabilidad logarítmica de cada conjunto de datos bajo la distribución de densidad del núcleo ajustada e identificamos el límite entre los dos modos como el primer valle en la probabilidad logarítmica. El límite entre los dos modos se utilizó como umbral de tamaño empírico para filtrar partículas de levadura para cada muestra (curva de 'filtrado de desechos' en la Fig. 1C).

LPFC estimó que la longitud de una fracción de huevos era de 200 a 400 µm (curva de 'filtrado de desechos' en la Fig. 1C) en todas las muestras, que es más pequeña que el rango de longitud de los huevos de Drosophila, es decir, 400 a 600 µm4,5. ,8,9,10. La medición manual de estos huevos mostró que LPFC subestimó su tamaño, probablemente debido a la orientación de los huevos durante la medición. Cuando un objeto elipsoide alargado pasa a través de la trayectoria del láser a lo largo de su eje mayor, el TOF registrado corresponde a su longitud (Fig. 1A). Pero si el objeto está desalineado, es decir, el objeto no pasa a lo largo del eje longitudinal, se subestimará el TOF y, posteriormente, la longitud (Fig. 1B). El uso de una solución de funda más viscosa, por ejemplo, 1 × PBS con 4% de metilcelulosa, reducirá el caudal y facilitará la alineación de los objetos a lo largo de su eje longitudinal al pasar por la trayectoria del láser (Fig. S2). Sin embargo, la viscosidad de la solución envolvente disminuye drásticamente la velocidad del análisis.

Por lo tanto, además del filtrado de desechos, utilizamos la información de densidad óptica para filtrar huevos desalineados que no estaban alineados en su eje longitudinal. La densidad óptica que mide la extinción de los objetos varía en función de la estructura de los objetos (Fig. 1A, B). Extrajimos la densidad óptica máxima registrada para un objeto (W) y el número total de mediciones de extinción a lo largo del tiempo de vuelo de cada objeto (L) y calculamos el índice de elipticidad (\(EI= \frac{Area}{\pi /4LW} \)) que es la relación entre el área bajo el perfil de densidad óptica de un objeto y el área del perfil elíptico más cercano20,25. Debido a la forma elíptica del huevo de Drosophila, un huevo alineado en el eje largo tiene una relación W/L menor que los huevos alineados en el eje corto (Fig. 1A, B). Para cada muestra, calculamos EI y W/L para todos los objetos y retuvimos los objetos distribuidos dentro de la mitad de la desviación estándar alrededor de la mediana de EI y W/L. Por último, después de filtrar objetos según EI y W/L, el primer modo de distribución de la longitud de los huevos de Drosophila, que corresponde a los huevos desalineados, se filtró de manera similar al paso de filtrado de desechos descrito anteriormente.

Para validar la precisión de la longitud estimada del huevo usando LPFC, medimos la longitud de los huevos manual y automáticamente usando LPFC. Alrededor de 2000 individuos de la población exógena de D. simulans fueron transferidos a dos jaulas de recolección de embriones con placas de agar de 10 mm cubiertas con pasta de levadura y pusieron huevos durante 17 a 19 h. Preparamos huevos para citometría de flujo como se describe anteriormente y clasificamos 74 huevos de 6 puertas correspondientes a 400–600 µm (con intervalos de 50 µm) en una placa de 96 pocillos. Durante el filtrado in-silico (descrito anteriormente), se filtraron los huevos desalineados con una longitud promedio estimada de 362 µm (N = 16 muestras, Tabla S2) mediante Biosorter®. Por lo tanto, clasificar los huevos desde puertas con una longitud estimada de 400 a 600 µm garantiza la ausencia de huevos desalineados. Luego medimos manualmente la longitud de los huevos clasificados. Transferimos los huevos a una placa de Petri de 100 mm que contenía un medio oscuro (4% de agar y 0,5% de carbón), colocamos los huevos en su lado dorsal y tomamos fotografías de alta resolución con un estereomicroscopio Leica (M205 FA). Medimos la longitud del huevo manualmente usando ImageJ26. La escala de las imágenes se transformó a µm y la longitud del huevo se midió trazando una línea a lo largo del eje longitudinal de cada huevo. La concordancia entre las mediciones de longitud manuales y las estimaciones de longitud automatizadas realizadas por LPFC se probó utilizando la correlación de rangos de Spearman.

Además, probamos si la inmersión en PBS influye en la medición de la longitud del huevo. Colocamos 46 huevos en su lado dorsal en una placa de Petri de 100 mm que contenía un medio oscuro y tomamos fotografías de alta resolución. Sumergimos los huevos en una placa de 96 pocillos durante 2,5 h, luego los transferimos a un medio oscuro y tomamos fotografías de alta resolución. Medimos la longitud del huevo manualmente usando ImageJ como se describe anteriormente. La concordancia entre las mediciones de la longitud del huevo antes y después de la inmersión en PBS se probó utilizando la correlación de Pearson.

Durante la medición de la longitud del huevo y la clasificación utilizando LPFC, los huevos pueden sumergirse en PBS durante varias horas. Además, si bien el LPFC emplea un caudal más lento y una presión más baja que la citometría de flujo tradicional para garantizar que los objetos clasificados sean viables, pasar a través del citómetro de flujo puede afectar la supervivencia de los óvulos. Realizamos un ensayo de viabilidad de óvulo a adulto para determinar el efecto de la inmersión en PBS y el paso a través de la celda de flujo en el desarrollo de óvulos hasta convertirse en adultos. Recolectamos huevos puestos por una población exógama de D. simulans durante 17 a 19 h, como se describe anteriormente en la Medición manual de la longitud del huevo. Para determinar la viabilidad de huevo a adulto de los huevos sin exposición a PBS, los huevos en la placa de agar no se lavaron con PBS (tratamiento 'sin PBS'); Se contaron manualmente 5 conjuntos independientes de 50 huevos y se transfirieron a 5 viales con un cepillo. Luego lavamos los huevos puestos sobre la pasta de levadura y transferimos alrededor de 30 μl de huevos a tres tubos de 1,5 ml que contenían 600 μl 1 × PBS; 2 tubos correspondieron a los tratamientos '0-h' y '4-h' y 1 tubo al tratamiento 'clasificado 4h'. Los huevos en los tratamientos de 0 h y 4 h se mantuvieron a temperatura ambiente (25 °C) durante solo 20 min y 4 h, respectivamente. Para cada tratamiento, se contaron manualmente 5 conjuntos independientes de 50 huevos bajo un estereoscopio y cada conjunto se transfirió a un vial que contenía medio estándar de Drosophila. Ejecutamos los huevos en el tratamiento de 'clasificación de 4 h' en LPFC y clasificamos 7 conjuntos independientes de 50 huevos desde puertas correspondientes a 400–600 μm, es decir, todo el rango de distribución de longitud de los huevos. Cada conjunto se transfirió a un vial. El número de adultos encerrados de cada vial para todos los tratamientos se contó durante 4 días consecutivos hasta que no se encerraron más moscas.

Para probar el efecto de la inmersión en PBS y la clasificación por LPFC sobre la viabilidad de huevo a adulto, ajustamos un modelo mixto lineal generalizado (usando una distribución binomial) con tratamiento, es decir, tiempo de inmersión y estado de clasificación, como un efecto categórico fijo con 4 niveles (sin PBS, 0 h, 4 h y clasificado 4 h). El modelo utilizado es el siguiente: Successij ~ μ + Treatmenti + errorij, donde el éxito es una matriz con el número de huevos sobrevivientes y muertos. Todos los tratamientos tienen un tamaño de muestra de 5 repeticiones, excepto el tratamiento clasificado de 4 h que tiene 7 repeticiones. Las réplicas se incluyeron como efecto aleatorio. La importancia del efecto fijo se probó mediante pruebas ANOVA F y utilizamos el HSD de Tukey para corregir pruebas múltiples.

La distribución de longitud de todas las muestras fue bimodal (Fig. 1C) y el tamaño promedio del primer y segundo modo fue 92,38 y 412,21 µm (n = 16 muestras, Tabla S1). Los objetos en el primer modo eran en su mayoría escombros y partículas de levadura tras la inspección manual. Usamos el borde calculado entre los dos modos como un umbral de tamaño empírico para eliminar los objetos en el primer modo. Estos umbrales empíricos específicos de la muestra oscilaron entre 92,9 y 212,21 µm con un promedio de 184,29 µm (n = 16 muestras, Tabla S1).

El segundo modo con un tamaño promedio de 412,21 µm (n = 16 muestras) corresponde a la longitud de los huevos de Drosophila4,5,8,9,10 pero también contenía algunos huevos desalineados (Fig. 1A,B). LPFC estimó la longitud de los huevos desalineados entre 200 y 400 µm (primer pico en la curva de 'filtrado de desechos' en la Fig. 1C), pero probablemente se subestimó debido a la orientación inadecuada de los huevos durante la medición. Para filtrar los huevos desalineados, calculamos el índice de elipticidad (EI) y la relación entre la densidad óptica máxima de un objeto y el número de mediciones de extinción a lo largo de los valores de tiempo de vuelo (W/L) de un objeto utilizando los datos de densidad óptica para cada uno. muestra. Cada conjunto de datos se filtró aún más eliminando los huevos que no estaban alineados en el eje longitudinal (Fig. 1B) y reteniendo objetos con valores de EI y W/L dentro de la mitad de la desviación estándar alrededor de la mediana. Como paso final para filtrar los huevos desalineados, eliminamos los objetos correspondientes al primer pico de la distribución de huevos (primer pico en la curva de 'Filtrado de desechos' en la Fig. 1C). Estos pasos de filtrado no eliminaron objetos con una longitud grande, lo que demuestra que los parámetros EI y W/L identifican adecuadamente los huevos desalineados donde la longitud está subestimada (Fig. 1C). El umbral empírico específico de la muestra calculado para filtrar estos objetos osciló entre 163,36 y 317,12 µm, con un promedio de 317,12 µm (n = 16 muestras, Tabla S2).

Validamos la precisión de las mediciones de la longitud de los huevos y la clasificación utilizando LPFC comparando la longitud estimada de los huevos por LPFC con las mediciones manuales. Clasificamos los huevos de varias puertas correspondientes a 400 a 600 μm, donde no hay huevos desalineados, y medimos la longitud de los huevos manualmente. Observamos una alta correlación entre las mediciones manuales y la longitud estimada utilizando LPFC (Fig. 2A). Además, evaluamos el efecto de la inmersión en PBS sobre la longitud del huevo. La longitud del huevo medida manualmente antes y después de 2,5 h de inmersión en PBS estuvo altamente correlacionada (Fig. 2B).

Precisión de la longitud estimada del óvulo mediante citometría de flujo de partículas grandes. (A) Los tamaños estimados mediante medición manual y citometría de flujo de partículas grandes están altamente correlacionados (correlación de rango de Spearman ρ = 0,84, valor p <0,001). (B) La inmersión en PBS no afecta la longitud del huevo ya que la longitud medida del huevo está altamente correlacionada antes y después de la inmersión en PBS (correlación de Pearson r = 0,9, valor p <0,001). La pendiente de las líneas discontinuas en A y B es 1.

La medición de la longitud del óvulo es rápida y de alto rendimiento. Medimos un promedio de 316 huevos/min, lo que corresponde a 214 huevos/min (n = 13 muestras) después de filtrar los huevos desalineados (Fig. 3A). Evaluamos la eficiencia de la clasificación como recuperación de clasificación, que es el porcentaje de objetos que se clasificaron y dispensaron como una fracción de todos los objetos que cumplían con los criterios de clasificación, es decir, el tamaño. En nuestras manos, la mediana de recuperación de clasificación fue del 63,54% (n = 28 muestras, Fig. 3B) y la velocidad mediana de clasificación fue de 69 huevos/min (n = 28 muestras, Fig. 3C).

Rendimiento de la medición del tamaño y clasificación de huevos mediante citometría de flujo de partículas grandes. (A) La velocidad media de medición del tamaño de los huevos es de 316 huevos/min después de filtrar los desechos (curva de 'Filtrado de desechos' en la Fig. 1C) y 214 huevos/min (n = 13 muestras) después de filtrar los huevos desalineados ('Filtrado desalineado'). 'curva en la Fig. 1C). (B) La recuperación de clasificación mediana como estimación de la eficiencia de la clasificación es 63,54% (n = 28 muestras). (C) La velocidad media de clasificación es de 69 huevos/minutos (n = 28 muestras).

Para demostrar la idoneidad del uso de LPFC para la medición y clasificación de huevos viables, probamos si los huevos clasificados se desarrollan normalmente hasta convertirse en adultos. No observamos diferencias significativas en la viabilidad de huevo a adulto entre los huevos que no se lavaron con PBS (42,4 ± 3,36 de 50) y los que se sumergieron brevemente en PBS durante 20 min (40,74 ± 6,08 de 50) y 4 h. (43,2 ± 5,12 de 50) (Fig. 4, un modelo mixto lineal generalizado seguido de la prueba HSD de Tukey con corrección para pruebas múltiples, Pno-PBS-0 h = 0,7307, Pno-PBS-4 h = 0,9567, P0hora-4 h = 0,4405). Además, los huevos que pasaron a través de LPFC no mostraron ninguna disminución en la viabilidad de huevo a adulto (42,57 ± 3,6 de 50) en comparación con los huevos sumergidos en 1 × PBS durante el mismo período de tiempo (43,2 ± 5,12 de 50) (Fig. .4, Pno-PBS clasificado 4 h = 1,0000, P0hora clasificado 4 h = 0,6673, P4hora clasificado 4 h = 0,9540).

La viabilidad de los óvulos no se reduce mediante la inmersión en PBS y la clasificación mediante citometría de flujo de partículas grandes. No hay diferencia significativa en la viabilidad de los huevos que no se lavaron con PBS (sin PBS), con los que se sumergieron en PBS durante 20 min (0 h) y 4 h (4 h). Pasar por el citómetro de flujo (clasificado en 4 h) tampoco reduce la viabilidad de óvulo a adulto (un modelo mixto lineal generalizado seguido de la prueba HSD de Tukey con corrección para pruebas múltiples, Pno-PBS-0 h = 0,7307, Pno- PBS-4 h = 0,9567, P0hora-4 h = 0,4405, Pno-PBS-ordenado 4 h = 1,0000, P0hora-ordenado 4 h = 0,6673, P4hora-ordenado 4 h = 0,9540).

Aquí, establecemos un método para la medición precisa y de alto rendimiento de la longitud del huevo de Drosophila utilizando citometría de flujo de partículas grandes. La medición de la longitud del huevo es muy precisa (Fig. 2), rápida y de alto rendimiento (Fig. 3A). Los huevos viables dentro de un rango de longitud específico se pueden clasificar rápidamente (Fig. 3C) sin reducir la viabilidad del huevo al adulto (Fig. 4).

La obtención de mediciones precisas y de alto rendimiento del tamaño de los huevos de Drosophila tiene varias aplicaciones. En primer lugar, este método de alto rendimiento es un enfoque adecuado para el uso de la longitud de los huevos de Drosophila como rasgo de la historia de vida en estudios a gran escala donde muchas poblaciones deben analizarse en paralelo. En segundo lugar, este enfoque permite un análisis de alto rendimiento de la variación en la longitud de los huevos en poblaciones naturales de diferentes especies de Drosophila. En tercer lugar, el alto rendimiento de la medición de la longitud del óvulo mediante citometría de flujo de partículas grandes junto con los paneles de referencia disponibles de D. melanogaster27 y D. simulans22 brindan la oportunidad de investigar la arquitectura genética de la variación de la longitud del óvulo a través del mapeo QTL y GWAS. En cuarto lugar, este método proporciona la posibilidad de clasificar huevos viables de Drosophila dentro del rango de distribución de longitud y realizar experimentos de selección con poblaciones de gran tamaño y repeticiones.

Las oportunidades que brinda LPFC para medir el tamaño del organismo no se limitan a los huevos de Drosophila y pueden aplicarse a cualquier organismo dentro del rango detectable de este instrumento (10 a 1500 μm). Nuestra recomendación es realizar experimentos preliminares para optimizar la configuración del instrumento para la muestra y aplicación específicas. Algunas de las configuraciones importantes para la optimización de la medición y clasificación incluyen el caudal, la velocidad de mezcla y la densidad de la muestra. El caudal se ajusta mediante la presión del recipiente de muestra y determina la cantidad de objetos analizados en una unidad de tiempo. El manual del usuario de Biosorter® recomienda ajustar el caudal para lograr entre 10 y 30 objetos por segundo. La velocidad de mezclado debe ajustarse para garantizar que los objetos no se dañen pero que también queden suspendidos de manera homogénea en el buffer. La densidad de muestra adecuada es un equilibrio entre la velocidad y la precisión de la medición y clasificación. Las muestras muy densas pueden potencialmente obstruir la celda de flujo y también dar como resultado una medición de tamaño inexacta si el instrumento no puede medir los objetos por separado. Por un lado, los eventos contaminados, es decir, los objetos que no cumplen los criterios de clasificación se encuentran en la misma entrega con el objeto que se puede clasificar, no se pueden clasificar. Por lo tanto, una densidad demasiado alta también puede reducir la recuperación de clasificación. Por otro lado, las muestras muy diluidas harán que el análisis sea largo. El peso de los objetos afecta el caudal y la velocidad de mezcla del análisis. Para objetos densos y pesados, como los huevos de Drosophila, la velocidad de mezclado debe ser rápida para mantener los objetos suspendidos. Además, la presión del vaso de muestra que afecta el caudal no puede ser demasiado baja ya que es posible que los objetos ni siquiera entren en la celda de flujo si se aplica una presión demasiado baja.

El número de huevos en cada corrida debe ajustarse para asegurar una estimación confiable de la distribución de tamaños. Nuestro algoritmo de filtrado in-silico ha identificado distintas fracciones correspondientes a desechos y huevos desalineados para muestras que contienen entre 1000 y 16 000 huevos (Tabla S2). Sin embargo, el algoritmo de filtrado puede requerir una optimización adicional si hay muy pocos objetos disponibles.

La configuración del instrumento y los pasos de filtrado deben ajustarse según el tamaño y la forma de los objetos. Si el tamaño del objeto es demasiado pequeño y se superpone con el tamaño de los escombros, es posible que se requiera una limpieza más intensiva para eliminar los escombros. Para objetos que tienen una forma aproximadamente esferoide, como las semillas de Arabidopsis19, la orientación del objeto no afecta el tamaño estimado por LPFC20. Sin embargo, se necesitan diferentes configuraciones de instrumentos y pasos de filtrado in silico para los objetos con formas que se desvían de una esfera. El método desarrollado en este estudio está optimizado para medir la longitud (el eje de simetría rotacional) de objetos elipsoides alargados (como el subgrupo de especies de D. melanogaster) o el ancho (el eje perpendicular a la longitud) de objetos elipsoides achatados. Recomendamos utilizar un paso de filtrado in-silico similar a nuestro estudio para eliminar residuos y objetos desalineados. Además, el uso de una solución de funda viscosa para reducir el caudal minimizará la cantidad de objetos desalineados (Fig. S2). Sin embargo, un caudal más bajo reducirá la velocidad del análisis. Además, la altura máxima promedio de densidad óptica (W), que utilizamos para filtrar objetos desalineados, también se puede utilizar en combinación con otros criterios de clasificación, por ejemplo, el tamaño, para aumentar la eficiencia de la clasificación de objetos. Si es necesario medir el ancho de un objeto elipsoide alargado o la longitud de un objeto elipsoide achatado, las especificaciones de ejecución deben optimizarse para maximizar la fracción de objetos en la orientación deseada que se medirán con LPFC. Además, los pasos de filtrado in-silico deben ajustarse para eliminar los objetos desalineados. Recomendamos que la clasificación de objetos según el tamaño se realice desde el rango de tamaño (es decir, puerta) para garantizar la ausencia de objetos desalineados.

Los citómetros de flujo de partículas grandes son instrumentos costosos que pueden no ser fácilmente adquiridos por pequeños grupos de investigación. Sin embargo, muchas instalaciones de investigación albergan instrumentos que pueden brindar acceso a los investigadores. La mayoría de los centros de investigación cuentan con personal capacitado que puede ayudar y capacitar a los investigadores.

Todos los datos y el código para reproducir los resultados están depositados en https://github.com/NedaBarghi/EggSizeBiosorterProtocol.

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Descargar referencias

Para la clasificación se utilizó el citómetro de flujo de partículas grandes BioSorter® (Union Biometrica, Holliston, MA) de la instalación FACS BioOptics de Max Perutz Labs (https://www.maxperutzlabs.ac.at/research/facilities/biooptics-facs). Agradecemos a Johanna Stranner y Kitti Dora Csalyi por su ayuda para optimizar el protocolo de clasificación. Agradecemos a Paula Marconi por su ayuda en el ensayo de viabilidad de óvulo a adulto. Agradecemos a Emmanouil Lirakis por su ayuda con el uso del estereomicroscopio Leica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF, P 32672) para NB. Agradecemos a Sara Signor (Universidad Estatal de Dakota del Norte) por proporcionar líneas endogámicas de D. simulans. Las cepas de Drosophila Lausanne5 (D. melanogaster), Dere01 (D. erecta), Dsan01 (D. santomea) y Dmau151 (D. mauritiana) se obtienen del centro de stock de Bloomington por Robert Kofler. Agradecemos a Samuel Church y a los revisores anónimos por sus comentarios constructivos sobre el manuscrito.

Instituto de Genética de Poblaciones, Vetmeduni Viena, Veterinärplatz 1, 1210, Viena, Austria

Neda Barghi & Claudia Ramirez-Lanzas

Escuela de Graduados en Genética de Poblaciones de Viena, Vetmeduni Viena, Viena, Austria

Claudia Ramirez-Lanzas

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NB concibió las ideas y diseñó la metodología; NB y CR-L. recopiló los datos; NB analizó los datos y dirigió la redacción del manuscrito. Todos los autores contribuyeron críticamente a los borradores y dieron la aprobación final para su publicación.

Correspondencia a Neda Barghi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Barghi, N., Ramirez-Lanzas, C. Un método de alto rendimiento para medir el tamaño de los huevos en Drosophila. Representante científico 13, 3791 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30472-8

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Recibido: 23 de diciembre de 2022

Aceptado: 23 de febrero de 2023

Publicado: 07 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30472-8

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